Революция в генном синтезе

Десять лет назад, когда Эмили Лепруст была директором по исследованиям в компании Agilent, пара ученых-инженеров в возрасте 50 лет - Билл Баньяй и Билл Пек - пришли к ней с идеей создания компании. Биллы, как их позже окрестили, были ветеранами биотехнологий. Пек был инженером-механиком по образованию и специализировался на механике жидкостей; Баньяй был экспертом по полупроводникам и работал в геномике с середины 2000-х годов, способствуя переходу от старой школы секвенирования Сэнгера, которая обрабатывает один фрагмент ДНК за раз, к секвенированию следующего поколения, которое обрабатывает миллионы фрагментов одновременно. Когда химический состав был миниатюризирован и помещен в кремниевый чип, считывание ДНК стало быстрым, дешевым и широко распространенным. Биллы, которые познакомились, когда Баньяй нанял Пека для работы над проектом по геномике, поняли, что есть возможность сделать нечто подобное для записи ДНК - сделать процесс создания синтетических генов более масштабируемым и экономически эффективным.

В то время синтез ДНК был медленным и трудным процессом. Реагенты - знаменитые основания (A, T, C и G), из которых состоит ДНК, - наносились пипеткой на пластиковую пластину с 96 ямками, или лунками, каждая из которых вмещала примерно 50 микролитров, что эквивалентно одной капле жидкости для пипетки. "В 96-луночном планшете концептуально все, что вам нужно сделать, - это поместить жидкость, перемешать, подождать, возможно, немного подогреть, а затем извлечь жидкость", - говорит Лепруст. Биллы предложили перенести этот же процесс на кремниевый чип, который при той же площади, что и 96-луночный планшет, сможет вместить миллион крошечных лунок, каждая из которых будет иметь объем 10 пиколитров, что составляет менее одной миллионной части размера 50-микролитровой лунки.

Поскольку лунки были настолько малы, они не могли просто наливать в них жидкости. Вместо этого они использовали для заполнения лунок струйный принтер, распределяя буквы А, Т, С и G, а не пигментные чернила. Катализатор под названием тетразол был добавлен для связывания оснований в одноцепочечную последовательность ДНК; усовершенствованная оптика сделала возможным идеальное выравнивание. В итоге вместо того, чтобы производить 96 фрагментов ДНК одновременно, теперь можно было печатать миллионы.

Концепция была проста, но, как говорит Лепруст, "инженерия была сложной". Когда вы синтезируете ДНК, объясняет она, выход, или процент успеха, снижается с каждым добавленным основанием. А и Т связываются друг с другом слабее, чем Г и Ц, поэтому последовательности ДНК с большим количеством последовательных А и Т часто нестабильны. В целом, чем длиннее нить ДНК, тем больше вероятность ошибок. Компания Twist Bioscience, которую основали Лепруст и Биллс, в настоящее время синтезирует самые длинные фрагменты ДНК в отрасли - до 300 пар оснований. Называемые олигосом, они могут быть соединены вместе для создания генов.

Сегодня компания Twist берет за ДНК девять центов за пару оснований, что почти в десять раз меньше, чем десять лет назад. Как клиент, вы можете зайти на сайт Twist, загрузить электронную таблицу с нужной вам последовательностью ДНК, выбрать количество и оплатить его кредитной картой. Через несколько дней ДНК будет доставлена к дверям вашей лаборатории. В этот момент вы можете ввести синтетическую ДНК в клетки и заставить их начать производить - надеюсь - целевые молекулы, на производство которых рассчитана ДНК. Эти молекулы в конечном итоге становятся основой для новых лекарств, пищевых ароматизаторов, искусственного мяса, удобрений нового поколения, промышленных продуктов для нефтяной промышленности. Twist - одна из многих компаний, продающих синтетические гены, делая ставку на будущее, наполненное биоинженерными продуктами с ДНК в качестве строительного материала.

В некотором смысле это будущее уже наступило. Синтез генов стоит за двумя крупнейшими "продуктами" прошлого года: мРНК-вакцинами от Pfizer и Moderna. Почти сразу после того, как в январе 2020 года китайский ЦКЗ впервые опубликовал геномную последовательность вируса SARS-CoV-2 в открытых базах данных, эти две фармацевтические компании смогли синтезировать ДНК, соответствующую определенному антигену вируса, называемому белком шипа. Это означает, что их вакцины - в отличие от традиционных аналогов, которые учат иммунную систему распознавать вирус путем введения ослабленной версии вируса - могут передавать генетические инструкции, побуждающие организм создавать именно белок spike, чтобы он был распознан и атакован во время настоящей вирусной инфекции.

Еще 10 лет назад это было бы практически неосуществимо. Исследователям было бы сложно синтезировать последовательность ДНК достаточной длины, чтобы закодировать полный белок spike. Но технический прогресс последних нескольких лет позволил разработчикам вакцины синтезировать гораздо более длинные фрагменты ДНК и РНК по гораздо более низкой цене и быстрее. Мы получили прототипы вакцин в течение нескольких недель, а вакцины на вооружение - в течение года.

Теперь компании и ученые смотрят в будущее после Ковида, когда синтез генов будет использоваться для решения множества других проблем. Если на первом этапе революции в геномике основное внимание уделялось чтению генов посредством секвенирования генов, то на втором этапе речь идет о написании генов. Crispr, технология редактирования генов, изобретатели которой в прошлом году получили Нобелевскую премию, привлекла гораздо больше внимания, но подъем генного синтеза обещает стать не менее мощным событием. Crispr - это как редактирование статьи, позволяющее нам вносить точные изменения в текст в определенных местах; синтез генов - это как написание статьи с нуля.

Как и многие другие технологии, находящиеся в стадии становления, генный синтез (наряду с областью, которую он породил, - синтетической биологией) вызвал большое количество спекуляций и стартапов. Большинство компаний - за исключением тех, которые работают над коронавирусом, - находятся на экспериментальной стадии; их приложения еще не дали убедительных результатов. Тем не менее, возможности привлекают инвесторов и ученых, будь то создание микроорганизмов для производства промышленных химикатов или инженерия человеческих клеток для лечения медицинских заболеваний. Если хотя бы небольшой процент этих усилий увенчается успехом, они могут привести к появлению рынков с триллионными оборотами. Аналогия, часто используемая венчурными капиталистами в области биотехнологий, заключается в том, что мы находимся во времена Apple II в синтетической биологии, а эквивалент iMac и iPhone еще впереди. Это грандиозное утверждение, но неправдоподобное, особенно сейчас, когда компания Covid испытала в бою некоторые базовые технологии. Персональные компьютеры создали наши цифровые жизни; чтение и запись ДНК может означать контроль над нашими физическими жизнями.

Среди афоризмов синтетической биологии есть и такой: Природа - лучший новатор. Например, CaS-9, "режущий" фермент, используемый в Crispr, изначально был защитным средством, которое бактерии выработали для борьбы с вирусами. Но этот афоризм не учитывает того факта, что на протяжении большей части истории человечества природа была непрозрачной и требовала, чтобы человечество натыкалось на ее изобретения совершенно случайно. Пенициллин, хинин - многие из наших основных лекарственных средств были открыты в результате того, что мы оставляли продукты надолго или находили активные ингредиенты в травяных сборах. Только с появлением современной химии мы смогли записывать формулы, которые используются в физике и математике.

Затем произошла революция в геномике. На первом этапе, отмеченном такими вехами, как секвенирование генома человека и появление таких компаний, как 23andMe, основное внимание уделялось чтению генов. Второй этап, который только начался, посвящен написанию генов. Теперь можно использовать наше понимание молекулярной биологии - как ДНК определяет последовательность РНК, которая, в свою очередь, определяет производство белков - и использовать Crispr и синтез ДНК для разработки генетических рецептов, которые производят нужные нам результаты. Как это выглядит на практике?

Один из крупнейших клиентов Twist - Ginkgo Bioworks, компания, занимающаяся клеточной инженерией, которая в сентябре под шумок вышла на биржу и к середине ноября была оценена в 25 миллиардов долларов. Главный офис Ginkgo занимает переоборудованный склад в районе морского порта Бостона. Когда я посетил его несколько месяцев назад, Патрик Бойл, руководитель Ginkgo, провел меня по пяти "литейным цехам" - названным так в честь заводов по производству микрочипов. Мы прошли мимо одной машины, использующей технологию микрофлюидики для смешивания реагентов и клеток, и другой, использующей масс-спектрометрию для быстрого анализа химического состава жидкостей.

На протяжении десятилетий основной рабочей единицей биологических исследований был скромный аспирант, который без устали пипетировал жидкости, проводил измерения, просматривал результаты и, если повезет, проводил несколько экспериментов в месяц. Ginkgo, напротив, привнес в лабораторию эффективность сборочного конвейера, используя машины, которые могут пипетировать, смешивать и анализировать с гораздо большей точностью, чем когда-либо мог сделать человек, что позволяет проводить тысячи различных экспериментов одновременно.

Ginkgo является "платформенной" компанией - вместо того, чтобы производить конечные продукты для себя, она разрабатывает клетки для своих клиентов. Процесс происходит примерно следующим образом: Клиент звонит в Ginkgo и говорит: "Мы хотим получить аромат розы для наших духов, который был бы дешевле, чем дистилляция из цветов". Дизайнеры Ginkgo прочесывают библиотеку генов и выбирают те, которые, как известно из предыдущих наблюдений или секвенирования, обладают характеристиками розового масла. После того как эти последовательности заложены в компьютер, Ginkgo заказывает ДНК у Twist или других поставщиков, которые выполняют большую часть работы по синтезу пар оснований.

В Ginkgo синтезированную ДНК затем вставляют в клетку-хозяина, возможно, дрожжи, которые начинают производить ферменты и пептиды. Далее следуют пробы и ошибки. Возможно, продукты, полученные из первой последовательности генов, слишком цветочные, недостаточно пряные; возможно, продукты из второй последовательности генов имеют нужный запах, но клетки производят его в недостаточном количестве. Как только найден эффективный прототип, Ginkgo увеличивает его производство, выращивая дрожжи в больших чанах и оптимизируя процесс извлечения нужных молекул из супа. Ginkgo предоставляет рецепт и ингредиенты - выигрышный генетический код, клетку-хозяина и условия, в которых нужно выращивать клетки, - которые клиент затем может использовать самостоятельно.

Сначала платформа Ginkgo привлекла клиентов в парфюмерной промышленности, но в последние два года она сотрудничает с фармацевтическими компаниями в поисках новых терапевтических средств. Один из таких проектов направлен на открытие нового поколения антибиотиков, чтобы противостоять устойчивости к антибиотикам. Люси Фоулстон, специализирующаяся на молекулярной микробиологии, возглавляет эту работу; вместе с ней работает Том Китинг, химик. Вместе они осветили для меня прекрасный, извращенный парадокс: большинство антибиотиков и большая часть устойчивости к антибиотикам исходят от самих бактерий. Бактерии несут генетические фрагменты с инструкциями по производству антимикробных молекул, которые убивают другие бактерии. Как правило, они также обладают способностью к самосопротивлению, так что бактерии, производящие конкретный антибиотик, не убивают сами себя, но эта устойчивость может передаваться среди бактерий, так что она становится широко распространенной.

Исторически сложилось так, что создание новых антибиотиков шло двумя путями. Первый, воспетый в историях об Александре Флеминге и заплесневелом хлебе, заключается в поиске их в природе: Ученые отправляются на природу, берут немного почвы из гейзера или кораллового рифа, помещают найденное в чашку Петри и смотрят, убивает ли оно какие-нибудь интересные бактерии. Второй подход заключается в прочесывании химических библиотек в поисках молекул, проявляющих антибактериальную активность. Вместе эти два подхода давали нам постоянный приток новых антибиотиков вплоть до 1980-х и 90-х годов, когда открытия стали иссякать.

"Было много спекуляций", - говорит Китинг. "Нашли ли мы все полезные антибиотики? Нашли ли мы все, что было легко найти? Неужели мы столкнулись с бактериями, которые теперь так трудно уничтожить, что новые найденные нами препараты на них не действуют?". Какова бы ни была причина, реальность такова, что у нас заканчиваются новые антибиотики в условиях растущей антибиотикорезистентности.

"Я думаю, что мы только начинаем изучать вопрос о том, можем ли мы запрограммировать биологию на то, что традиционно делали химики".

Проект по антибиотикам в Гинкго ищет в геномах бактерий сегменты, закодированные для создания новых противомикробных препаратов. Усилия по секвенированию в 90-х и 2000-х годах привели к созданию больших баз данных бактериальных геномов, как государственных, так и частных, которые дали ученым все более сложное понимание того, какие гены производят те или иные молекулы. Кроме того, ученые разработали необходимые методы, чтобы, как говорит Фоулстон, "извлечь эти гены, поместить их в другой штамм бактерий" - тот, с которым они умеют работать - "а затем заставить этот штамм производить интересующую молекулу".

Китинг продолжает: "Нам больше не нужен организм. Нам не нужно, чтобы он рос на тарелке. Нам не нужно, чтобы он убивал что-то еще. Все, что нам нужно, - это код".

Сколько бы метафор программирования вы ни использовали, ДНК сложнее кода. Если вы набираете "print 'hello world'", вы ожидаете, что компьютер выдаст "hello world". Если вы синтезируете последовательность ДНК, ACTCAG, и поместите ее в клетку, вы, возможно, сможете с некоторой долей уверенности предсказать, что выйдет из клетки, но на самом деле вы никогда этого не узнаете.

Тем не менее, в биотехнологиях наступил новый момент - момент, когда программное обеспечение, аппаратные средства, наука о данных и лабораторная наука наконец-то стали достаточно зрелыми, чтобы работать вместе и подкреплять друг друга. Вакцины на основе мРНК, которые до пандемии не были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, являются ярким примером; проект Ginkgo по производству антибиотиков - еще один. А дальнейшие достижения в области машинного обучения и компьютерного моделирования только умножат возможности. То же самое относится и к полупроводникам: Какой бы маленькой ни казалась одна из 10-пиколитровых скважин компании Twist, Лепруст отмечает, что с точки зрения полупроводниковой промышленности 21 века это "Большой каньон, почти как в каменном веке". Компания уже экспериментирует с чипами, чьи ячейки более чем в 300 раз меньше, с диаметром 150 нанометров. (Для сравнения, Intel сейчас производит семинанометровые кремниевые чипы для компьютеров). Этот прогресс обещает снизить стоимость синтеза генов в миллион раз и сделать его доступным для все большего числа исследователей и полезным для все большего числа экспериментов и приложений.

Для синтетической биологии следующий рубеж - это путь туда, куда не дошла даже природа. Вместо того чтобы пытаться воспроизвести аромат розы, можем ли мы комбинировать гены для получения еще более пьянящих ароматов? Можем ли мы превратить ДНК в цепи, которые позволят клеткам действовать как живые компьютеры? "Пока что мы просто берем то, что уже придумано природой, копируем это, возможно, оптимизируем", - говорит Китинг. Но он стремится к такой командной и творческой власти, какой сейчас обладают химики, которые могут синтезировать все, что можно изобразить на схеме. "Я думаю, что мы только начинаем изучать вопрос о том, можем ли мы запрограммировать биологию на то, что традиционно делали химики", - говорит он. "Если вы можете нарисовать молекулу на листе бумаги, можем ли мы спроектировать организм для производства этой молекулы, даже если это что-то, чего природа никогда раньше не видела? Мы еще не приблизились к этому - но, знаете, это маленькие шаги".